|
|
Critical sites determining the resistance phenotype of ABC proteins from the ARE subfamily and the molecular mechanism of their function
Lenart, Jakub
Rezistenční proteiny Vga(A) a Msr(A) patřící do ARE podrodiny ABC-F proteinů udělují rezistenci k antimikrobiálním látkám, k tzv. inhibitorům peptidyltransferázového centra. V minulosti se předpokládalo, že jejich mechanizmus rezistence je založen na interakci s transmembránovým partnerem za vytvoření funkčního transportéru. Prostřednictvím kryoelektronové mikroskopie a mutant neschopných hydrolýzy ATP bylo popsáno jejich působení na ribozomu. I když byla jejich lokalizace popsána, přesný mechanismus působení není do dnešního dne znám. Přípravou mutovaných proteinů kombinujících čtyři aminokyselinové zbytky Vga(A) a Vga(A)LC ve špičce linkeru, jsme jako první popsali vliv substrátové specificity jednotlivých mutant. Aminokyselinová pozice 212 a 220 je důležitá pro rezistenci k linkosamidům a pleuromutilínům, přičemž pozice 219 k streptogramínům A. Povaha jednotlivých aminokyselin hraje zásadní roli v udělování antibiotické specificity, co potvrzuje fakt, že aminokyselinová záměna v pozici K218T na pozadí proteinu Vga(A) způsobila posun rezistence od streptogramínů k linkosamidům a pleuromutilínům. Mechanizmus rezistence u buněk exprimujících vga(A) spočívá v ribozomální ochraně. Tomu také nasvědčuje fakt, že míra akumulace [3H]-linkomycinu u Vga(A) je velmi podobná s kmenem exprimujícím erm(C)....
|
|
|
Rezistence k antibiotikům udílená proteiny ARE podrodiny ABC proteinů
Veselá, Ludmila ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Borčin, Kateřina (oponent)
Hlavním tématem této práce je ARE podrodina ABC transportérů. Důležitost proteinů této podrodiny spočívá v tom, že udělují rezistenci k několika skupinám klinicky důležitých antibiotik: makrolidům, linkosamidům, streptograminům a pleuromutilinům a to u významných patogenů jakým je např. Staphylococcus aureus. Na rozdíl od klasických ABC transportérů struktura ARE proteinů postrádá transmembránovou doménu (TMD) a prozatím nebyl nalezen ani interagující transmembránový protein. Z toho důvodu není jasný mechanismus udílení rezistence. V práci diskutujeme obě navrhované hypotézy mechanismu funkce těchto proteinů. První je aktivní efflux antibiotika ven z bakterie. Druhá hypotéza spočívá v uvolnění antibiotika z jeho vazebného místa, které je iniciované ARE proteiny, a jeho následná pasivní difuse ven z buňky. Klíčová slova: ABC proteiny, ARE proteiny, rezistence, MLS, Vga
|
|
|
Lekce z přírody - příprava hybridních bioaktivních látek
Vobruba, Šimon ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Zikánová, Blanka (oponent)
Sekundární metabolity jsou biologicky aktivní látky, produkované především mikroorganismy. Zpravidla nejsou nezbytné pro přežití produkujících mikroorganismů, nicméně ovlivňující jejich fyziologii a mikrobiální ekologii. Mnoho z nich je využíváno ve farmacii, biologii a chemii. Tato práce shrnuje poznatky o původu a směru vývoje sekundárních metabolitů. Důležitou vlastností genů kódujících sekundární metabolity je jejich organizace do shluků. Mezi popsané mechanismy modifikací genových shluků pro biosyntézu sekundárních metabolitů patří mutace genů či intragenové přestavby. Ty se v přírodě výrazně projevují v evoluci shluků, kódujících sekundární metabolity s modulárním typem syntézy. Může však také docházet k fúzi genových podshluků rozdílného původu za vzniku komplexních shluků kódujících biosyntézu hybridní látky. Tyto hybridní shluky obsahují geny pocházející ze shluků různých sekundárních metabolitů. Podobná evoluční událost pravděpodobně nastala i v případě biosyntézy dvou modelových skupin přírodních látek - linkosamidů a pyrrolobenzodiazepinů. Analogické principy využívá i genové inženýrství pro cílené modifikace biosyntetických genových shluků, za účelem konstrukce producentů účinnějších biologicky aktivních látek. V práci jsou uvedeny příklady takových úprav, a to jak u látek ze skupin...
|
|
|
Critical sites determining the resistance phenotype of ABC proteins from the ARE subfamily and the molecular mechanism of their function
Lenart, Jakub ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Melter, Oto (oponent) ; Branny, Pavel (oponent)
Rezistenční proteiny Vga(A) a Msr(A) patřící do ARE podrodiny ABC-F proteinů udělují rezistenci k antimikrobiálním látkám, k tzv. inhibitorům peptidyltransferázového centra. V minulosti se předpokládalo, že jejich mechanizmus rezistence je založen na interakci s transmembránovým partnerem za vytvoření funkčního transportéru. Prostřednictvím kryoelektronové mikroskopie a mutant neschopných hydrolýzy ATP bylo popsáno jejich působení na ribozomu. I když byla jejich lokalizace popsána, přesný mechanismus působení není do dnešního dne znám. Přípravou mutovaných proteinů kombinujících čtyři aminokyselinové zbytky Vga(A) a Vga(A)LC ve špičce linkeru, jsme jako první popsali vliv substrátové specificity jednotlivých mutant. Aminokyselinová pozice 212 a 220 je důležitá pro rezistenci k linkosamidům a pleuromutilínům, přičemž pozice 219 k streptogramínům A. Povaha jednotlivých aminokyselin hraje zásadní roli v udělování antibiotické specificity, co potvrzuje fakt, že aminokyselinová záměna v pozici K218T na pozadí proteinu Vga(A) způsobila posun rezistence od streptogramínů k linkosamidům a pleuromutilínům. Mechanizmus rezistence u buněk exprimujících vga(A) spočívá v ribozomální ochraně. Tomu také nasvědčuje fakt, že míra akumulace [3H]-linkomycinu u Vga(A) je velmi podobná s kmenem exprimujícím erm(C)....
|
|
|
Mechanismus inducibilní genové exprese rezistenčního proteinu Vga(A)LC ze Staphylococcus haemolyticus
Novotná, Michaela ; Balíková Novotná, Gabriela (vedoucí práce) ; Lišková, Petra (oponent)
Protein VgaA za stafylokoků patří do skupiny ARE ABCF proteinů, které udílejí rezistenci k antibiotikům vázajícím se na 50S ribozomální podjednotku mechanismem ochrany cílového místa. VgaA udílí rezistenci k linkosamidům, streptograminům A a pleuromutilinům a poskytuje tak tzv. LSAP rezistenční fenotyp. Exprese rezistenčních genů v nepřítomnosti antibiotika často snižuje fitness, proto je jejich exprese přísně kontrolována a spouštěna pouze v odpovědi na přítomnost antibiotika, ke kterému daný protein udílí rezistenci. V případě genu vgaA byla inducibilní exprese taktéž pozorována, její mechanismus však nebyl dosud objasněn. V rámci diplomové práce bylo ukázáno, že gen vgaALC ze Staphylococcus haemolyticus je regulován pomocí ribozomem zprostředkované atenuace. Tento mechanismus je založen na detekci inhibitorů translace prostřednictvím ribozomu překládajícího speciální regulační otevřený čtecí rámec (uORF), který je součástí atenuátoru lokalizovaného v 5' nepřekládané oblasti mRNA. Gen vgaALC je regulován na transkripční úrovni v odpovědi na LSAP antibiotika, přičemž antibiotická specificita indukce je ovlivňována nejen charakterem peptidu kódovaného uORF, ale také antibiotickou specificitou rezistenčního proteinu. Technikou fluorescenční mikroskopie bylo ukázáno, že protein kontrolovaný...
|
|
|
Studium klíčových bodů biosyntézy linkomycinu a celesticetinu
Vobruba, Šimon ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Bobek, Jan (oponent) ; Kutejová, Eva (oponent)
Linkosamidy tvoří malou, ale důležitou skupinu specializovaných bakteriálních metabolitů s antimikrobiálními účinky, mezi jejíž nejvýznamnější zástupce patří linkomycin a celesticetin. Strukturně se linkosamidy skládají z aminocukru a aminokyseliny, navzájem propojených amidovou vazbou. Aminokyselinové prekurzory linkosamidů se od sebe nicméně významně liší. Prekurzorem celesticetinu je proteinogenní L-prolin, zatímco u významně účinnějšího linkomycinu je jím neobvyklá aminokyselina (2S,4R)-4-propyl-L-prolin (PPL). Přesto jsou tyto prekurzory rozpoznávány a aktivovány homologními adenylačními doménami CcbC, resp. LmbC. A právě tento, pro biologickou aktivitu výsledné látky klíčový mechanismus rozpoznání a aktivace aminokyselinového prekurzoru, je předmětem této práce. Nejprve byly za využití cílené mutageneze a biochemické charakterizace mutant identifikovány aminokyselinové zbytky v adenylační doméně LmbC, nezbytné pro aktivaci PPL. Na základě těchto dat byla následně experimentálně napodobena molekulární evoluce substrátové specifity adenylační domény směrem od L-prolinu (jako u CcbC) k PPL (LmbC), kdy bylo dosaženo změny substrátové specifity mutací pouhých tří aminokyselinových zbytků ve vazebném místě pro substrát. Aktivované aminokyselinové prekurzory jsou v biosyntézách linkosamidů dále...
|
|
|
Ergothionein a mykothiol v biosyntéze linkosamidů
Seidlová, Bára ; Kameník, Zdeněk (vedoucí práce) ; Kopecký, Jan (oponent)
Specializované mikrobiální metabolity jsou popisovány jako nízkomolekulární bioaktivní látky, které svému producentovi neslouží pro růst, vývoj, ani reprodukci. Do této skupiny látek se řadí také linkosamidy, produkované převážně některými druhy bakterií z rodu Streptomyces. Součástí biosyntézy těchto antibiotik jsou mimo jiné dva nízkomolekulární thioly, ergothionein (ESH) a mykothiol (MSH). Mykothiol v této biosyntetické dráze figuruje jako zdroj síry, zatímco ergothionein tvoří s aminooktosovou jednotkou konjugát, který je jakožto substrát neobvyklého kondenzačního enzymu následně schopný vazby s enzymaticky aktivovanou aminokyselinou. Cílem této práce je izolace substrátu enzymu LmbD - linkomycinového biosyntetického konjugátu ESH a aminooktosy. Dalším cílem je pak studovat propojení metabolismu MSH a ESH s biosyntézou linkosamidů, konkrétně linkomycinu, celesticetinu a intervencinu, které jsou produkovány třemi různými kmeny. Bakteriální kmeny byly kultivovány v laboratorních podmínkách a k jednotlivým analýzám byly použity metody kapalinové chromatografie s UV a MS detekcí, jejichž konkrétní parametry byly vyvinuty a optimalizovány v rámci této diplomové práce. Výsledkem této diplomové práce je purifikovaný konjugát ESH s aminooktosovou jednotkou o hmotnosti 1,39 mg a čistotě 71,4 %. Dále se...
|
|
|
Substrátová specifita adenylačních domén synthetas v sekundárním metabolismu.
Vobruba, Šimon ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Fišer, Radovan (oponent)
Klíčovým krokem biosyntézy linkosamidových antibiotik je kondenzace řízená oligomerním enzymem linkosamidsyntetázou (LS). Tento unikátní enzym katalyzuje spojení aminokyselinové a aminocukerné složky obou linkosamidů - linkomycinu a celesticetinu. Jednou z nejdůležitějších komponent LS je adenylační doména rozpoznávající a aktivující aminokyselinové prekurzory. Substrátová specifita adenylační domény je určena souborem 10 aminokyselinových zbytků, nazývaných neribozomální kód, jejichž postranní řetězce jsou v kontaktu se substrátem. Homologní adenylační domény LmbC z biosyntézy linkomycinu a CcbC z biosyntézy celesticetinu aktivují odlišné aminokyselinové prekurzory (2S,4R)-4-propyl-L-prolin (PPL) resp. L-prolin. V první části práce byl experimentálně otestován vliv vybraných aminokyselinových zbytků neribozomálního kódu LmbC na substrátovou specifitu celé domény. Byly určeny aminokyselinové zbytky, jejichž postranní řetězce mají největší význam pro preferenci PPL substrátu oproti L-prolinu: G308, A207 a L246. V druhé části práce byl posuzován vliv dvojitých mutací v neribozomálním kódu LmbC a CcbC na substrátovou specifitu obou domén. Byly připraveny a biochemicky charakterizovány domény LmbC G308V + A207F a CcbC V306G + F205A. Výsledky obou bloků experimentů přinesly nové důkazy pro platnost homologních...
|
|
|
Lekce z přírody - příprava hybridních bioaktivních látek
Vobruba, Šimon ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Zikánová, Blanka (oponent)
Sekundární metabolity jsou biologicky aktivní látky, produkované především mikroorganismy. Zpravidla nejsou nezbytné pro přežití produkujících mikroorganismů, nicméně ovlivňující jejich fyziologii a mikrobiální ekologii. Mnoho z nich je využíváno ve farmacii, biologii a chemii. Tato práce shrnuje poznatky o původu a směru vývoje sekundárních metabolitů. Důležitou vlastností genů kódujících sekundární metabolity je jejich organizace do shluků. Mezi popsané mechanismy modifikací genových shluků pro biosyntézu sekundárních metabolitů patří mutace genů či intragenové přestavby. Ty se v přírodě výrazně projevují v evoluci shluků, kódujících sekundární metabolity s modulárním typem syntézy. Může však také docházet k fúzi genových podshluků rozdílného původu za vzniku komplexních shluků kódujících biosyntézu hybridní látky. Tyto hybridní shluky obsahují geny pocházející ze shluků různých sekundárních metabolitů. Podobná evoluční událost pravděpodobně nastala i v případě biosyntézy dvou modelových skupin přírodních látek - linkosamidů a pyrrolobenzodiazepinů. Analogické principy využívá i genové inženýrství pro cílené modifikace biosyntetických genových shluků, za účelem konstrukce producentů účinnějších biologicky aktivních látek. V práci jsou uvedeny příklady takových úprav, a to jak u látek ze skupin...
|
|
|
Společné rysy biosyntetických drah linkomycinu, některých pyrrolo-1,4-benzodiazepinů a hormaomycinu
Steiningerová, Lucie ; Janata, Jiří (vedoucí práce) ; Mašek, Tomáš (oponent)
Linkosamidy, pyrrolo-1,4-benzodiazepiny (PBD) i hormaomycin jsou biologicky aktivní látky odlišné svou strukturou i mechanizmem působení. Linkosamidy linkomycin a klindamycin jsou antibiotika využívaná v klinické a veterinární praxi např. v léčbě anaerobních infekcí. PBD jsou testovány pro svou protinádorovou aktivitu, hormaomycin je bakteriální hormon. Linkomycin má do své struktury začleněn neobvyklý prekurzor, 4- propyl-L-prolin (PPL), vznikající z L-tyrosinu. Hormaomycin i některé PBD (tomaymycin, anthramycin, sibiromycin) mají i přes celkovou strukturní nepodobnost s linkomycinem ve své struktuře integrován prolinový motiv s dvou- nebo tří- uhlíkatým postranním řetězcem, stejného biosyntetického původu jako PPL. V biosyntetických genových shlucích příslušných sekundárních metabolitů lze proto nalézt pět nebo šest ortologních genů kódujících biosyntézu těchto strukturně podobných prekurzorů. Existuje zřetelná evoluční souvislost biosyntézy linkomycinu, hormaomycinu a některých PBD. Není však známo, kde unikátní PPL dráha vznikla, rozvíjela se, jaké existují v přírodě její další modifikace, ani jaké byly cesty přenosu biosyntetických genů mechanizmem horizontálního genového přenosu. Odpovědi na tyto otázky jsou významné zejména z pohledu přípravy nových hybridních látek s lepšími bioaktivními účinky.
|
host ::
RSS.